DSpace - Tor Vergata >
Facoltà di Medicina e Chirurgia >
Tesi di dottorato in medicina >

Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2108/804

Full metadata record

DC FieldValueLanguage
contributor.advisorCalabresi, Paolo-
contributor.authorGhiglieri, Veronica-
date.accessioned2009-02-19T09:28:47Z-
date.available2009-02-19T09:28:47Z-
date.issued2009-02-19T09:28:47Z-
identifier.urihttp://hdl.handle.net/2108/804-
description20. cicloen
description.abstractLa delezione funzionale della proteina presinaptica Bassoon (Bsn), che fa parte delle proteine scaffolding deputate al corretto assemblaggio e fusione delle vescicole sinaptiche nel processo di release, è associata con l’insorgenza di crisi epilettiche spontanee e con alterazioni nell’attività neuronale e nella morfologia di corteccia a ippocampo. Dato che ricevono numerose afferenze corticali attraverso lo striato, i gangli della base (GB) sono stati implicati nella patogenesi dell’epilessia, anche se il loro ruolo, e in particolare quello del microcircuito striatale, nel limitare la propagazione dell’attività epilettogena è ancora argomento di discussione. Per studiare il ruolo dei GB nell’epilessia abbiamo ipotizzato che la propagazione delle scariche epilettiche dalla corteccia verso lo striato potesse indurre, come meccanismo adattativo, un’alterazione dell’eccitabilità a lungo e breve termine di due sottopopolazioni neuronali del microcircuito striatale: i neuroni di proiezione spinosi e gli interneuroni GABAergici fast-spiking (FS). A questo scopo ci siamo proposti di caratterizzare il fenotipo epilettico e le capacità di apprendimento dei mutanti Bsn e di studiarne la plasticità striatale e ippocampale tramite registrazioni elettrofisiologiche, saggi molecolari e analisi morfologiche. Le crisi epilettiche dei mutanti sono state quindi monitorate e classificate e l’apprendimento procedurale e ippocampo-dipendente valutato attraverso una batteria di test comportamentali. Le registrazioni intracellulari sono state effettuate in vitro da fettine corticostriatali mentre registrazioni extracellulari sono state ottenute da fettine ippocampali. L’espressione di proteine associate al compartimento postsinaptico è stata poi valutata tramite analisi del Western blot mentre uno studio morfologico dei neuroni spinosi e degli interneuroni FS è stato effettuato con la colorazione di Golgi e tecniche di immunoistochimica. I topi mutanti per la proteina Bsn mostravano uno sviluppo di crisi epilettiche ad insorgenza precoce che negli adulti erano associate a un riarrangiamento della plasticità sinaptica all’interno del microcircuito striatale. Sebbene infatti la depressione a lungo termine (LTD) fosse espressa ugualmente nei due genotipi, il potenziamento a lungo termine (LTP) indotto nei neuroni spinosi dei mutanti era ridotto rispetto ai controlli, mentre la LTP ippocampale era completamente assente. L’alterazione striatale era associata a un aumento significativo delle ramificazioni dendritiche e delle spine immature nei neuroni spinosi e a profonde alterazioni di alcune proteine postsinaptiche di importanza fondamentale per la LTP. Le analisi molecolari hanno rilevato infatti che la composizione in subunità del recettore NMDA era profondamenre cambiata, i livelli di BDNF ridotti mentre l’espressione di recettore TrkB nella membrana postsinaptica era significativamente aumentata. Tuttavia, l’aspetto più interessante del pattern di modificazioni osservate in striato era che gli interneuroni FS dei mutanti Bsn presentavano una forma di potenziamento a breve termine della trasmissione sinaptica, non presente nei controlli. Questa forma di plasticità emergente era NMDA- e BDNF-dipendente e si accompagnava a un aumento significativo del numero degli interneuroni nello striato dei topi epilettici rispetto agli animali di controllo. Infine i test comportamentali hanno mostrato che gli animali mutanti presentavano capacità di apprendimento procedurale intatte, mentre presentavano performances ridotte in test di memoria ippocampo-dipendente. I nostri risultati dimostrano che mentre nei topi mutanti per la proteina Bsn si osserva una compromissione della plasticità ippocampale con perdita delle funzioni mnemoniche ippocampo-dipendenti, i sottotipi neuronali dello striato rispondono con meccanismi differenti all’attività epilettogena cronica corticale creando un quadro di riorganizzazione funzionale che preserva funzioni motorie e cognitive. Data l’insorgenza precoce della sintomatologia epilettica, il riarrangiamento della connettività neuronale nello striato e della plasticità sinaptica corticostriatale che si osserva negli adulti potrebbero essere intrerpretati come meccanismi di adattamento volti a proteggere la funzionalità dei GB.en
description.abstractAbsence of functional presynaptic scaffolding protein Bassoon (Bsn) in mutant mice is associated with the development of pronounced spontaneous seizures and with consistent alterations in neuronal activity and morphology of hippocampus and cerebral cortex. The basal ganglia network receives a strong glutamatergic series of inputs from cortical regions through the striatum and it has been involved in the pathophysiology of epilepsy. However its functions, and in particular the role of the striatal microcircuit, in limiting epileptogenesis is still debated. To further investigate on the role of BG in limiting epileptic activity, we hypothesized that the spreading of epileptic seizures from the cortex to the striatum may alter both short and long-term excitability in two neuronal subtypes, the striatal fast-spiking GABAergic interneurons (FS) and the medium spiny (MS) neurons as an adaptive mechanism. To this end we first planned to study the epileptic phenotype and the learning skills of mutants. We then propose to characterize the plastic changes by electrophysiological recordings, molecular analyses and morphological studies. Epileptic seizures in mutant mice were video-recorded, classified and procedural learning and hippocampal-based learning skills were evaluated with a battery of behavioral tests. In vitro intracellular recordings were performed from corticostriatal slices obtained from Bsn mutants and WT mice while extracellular recordings were performed in hippocampal slices. Postsynaptic proteins were analyzed by Western blotting while morphological studies of FS and MS were performed in epileptic mice brain with Golgi-staining and unbiased immunohystochemical technique. Bsn mutant mice showed early-onset epileptic seizure development, which in adults were associated to a rearrangement of synaptic plasticity within the striatal microcircuit. In fact, although long-term depression (LTD) was equally expressed in both genotypes, the amplitude of long-term potentiation (LTP) induced in MS neurons of Bsn mutant mice was reduced compared to control, while hippocampal LTP was completely lost. The alteration in striatal plasticity was associated to differences in dendrite branching and spine maturation of MS neurons and to profound modifications of postsynaptic components expression in the whole striatum. In particular, in the striatum of epileptic mice, the NMDA subunit composition was found altered, the BDNF expression decreased and TrkB receptor upregulated. Interestingly, following high frequency stimulation protocol, GABAergic FS recorded from Bsn mutant mice expressed a NMDA and BDNF-dependent short-term potentiation that was absent in WT animals. Moreover FS interneurons were increased in number in the epileptic genotype. Behavioral tests for assessment of learning skills demonstrated that procedural learning capabilities are intact while hippocampal-based functions are compromised in epileptic mice providing evidences for a competition between the two memory systems. Our results indicate that while hippocampal synaptic plasticity is lost, striatal neuronal subtypes are differentially sensitive to continuous seizures and to the associated alterations of BDNF/TrkB signaling. These data suggest that changes of corticostriatal activity develop in early-onset epileptic conditions associated to the lack of functional Bsn. The reorganization of plasticity between neuronal subtypes may protect striatum and downstream BG nuclei from continuous cortical seizures in order to preserve striatal functions.en
description.tableofcontents1.1 I GANGLI DELLA BASE - 1.2 LO STRIATO - 1.2.1 I neuroni spinosi striatali - 1.2.2 Gli interneuroni striatali - 1.3 LA PLASTICITÀ SINAPTICA CORTICOSTRIATALE - 1.4 EPILESSIA - 1.5 MODELLI SPERIMENTALI DI EPILESSIA - 1.6 GANGLI BASALI E EPILESSIA - 1.7 LA PROTEINA PRESINAPTICA BASSOON - 1.8 I DEFICIT IPPOCAMPALI - 1.9 IL BDNF - 1.9.1 Il BDNF e l’epilessia - 1.10 IL FATTORE DI TRASCRIZIONE NUCLEARE NF-B. - 2 OBIETTIVI DELLA RICERCA. - 3 MATERIALI E METODI - 3.1 ANIMALI - 3.2 IMPIANTO CANNULE INTRASTRIATALI - 3.3 COMPORTAMENTO - 3.4 STUDIO ELETTROFISIOLOGICO DEI NEURONI STRIATALI E IPPOCAMPALI - 3.5 ANALISI MORFOLOGICA DEI NEURONI SPINOSI STRIATALI - 3.6 ANALISI IMMUNOISTOCHIMICA DEGLI INTERNEURONI FS - 3.7 QUANTIFICAZIONE DELL’ESPRESSIONE DI COMPONENTI DELLA POST SYNAPTIC DENSITY (PSD) MEDIANTE L’ANALISI DEL WESTERN BLOTTING - 3.8 ANALISI MOLECOLARE DI BDNF E TRKB - 3.9 ANALISI DELL’ATTIVAZIONE DEL FATTORE DI TRASCRIZIONE NF-B - 3.10 AGENTI FARMACOLOGICI. - 4 RISULTATI - 4.1 RUOLO DELLA PROTEINA PRESINAPTICA BASSOON NELLO STRIATO - 4.1.1 Caratterizzazione del fenotipo epilettico in mutanti Bsn - 4.1.2 Caratterizzazione elettrofisiologica dei neuroni spinosi striatali - 4.1.3 Studio morfologico dei neuroni spinosi striatali - 4.1.4 Analisi Della PSD - 4.1.5 Caratterizzazione elettrofisiologica degli interneuroni fast-spiking (FS) striatali - 4.1.6 Studio immunoistochimico degli interneuroni FS striatali - 4.2 STRIATO E IPPOCAMPO - 4.2.1 Studio comportamentale nei mutanti Bsn: apprendimento striatale e apprendimento ippocampale - 4.2.2 Studio della plasticità sinaptica ippocampale in mutanti Bsn - 4.2.3 Ruolo del NF-kB nell’ippocampo dei mutanti Bsn - 4.3 IL BDNF - 4.3.1 Manipolazione farmacologica del signaling del BDNF in striato, un approccio elettrofisiologico e comportamentale - 4.3.2 Approccio morfologico al sistema di trasmissione del BDNF nello striato - 4.3.3 Studio molecolare dell’espressione di BDNF e Trk B nello striato. - 5 DISCUSSIONE - 5.1 RUOLO FUNZIONALE DI BASSOON NELLO STRIATO - 5.2 STRIATO E IPPOCAMPO - 5.3 IL BDNF. - 6 CONCLUSIONI. - 7 APPENDICE A - TEST DICHIARATIVI, IPPOCAMPO – DIPENDENTI. - 7.1 MATERIALI E METODI - 7.1.1 Morris water maze o labirinto ad acqua di Morris - 7.1.2 Context fear conditioning o condizionamento avversivo al contesto - 7.2 RISULTATI - 7.2.1 Morris water maze - 7.2.2 Condizionamento avversivo al contesto. - 8 APPENDICE B - TEST ELETTROFISIOLOGICI - 8.1 MATERIALI E METODI - 8.2 RISULTATI - 8.2.1 Analisi della paired-pulse facilitation - 8.2.2 Effetto del K252a sulla plasticità sinaptica ex vivo. - Bibliografiaen
format.extent485315 bytes-
format.extent2244397 bytes-
format.mimetypeapplication/pdf-
format.mimetypeapplication/pdf-
language.isoiten
subjectplasticità sinaptica corticostriataleen
subjectepilessiaen
subjectinterneuroni fast-spikingen
subjectBDNFen
subjectneuroni spinosien
subjectapprendimento proceduraleen
subjectippocampoen
subject.classificationMED/26 Neurologiaen
titleLa proteina presinaptica Bassoon regola la plasticità sinaptica in cellule striatali: caratterizzazione elettrofisiologica, molecolare, morfologica e comportamentale di un modello sperimentale di epilessiaen
typeDoctoral thesisen
degree.nameDottorato in neuroscienzeen
degree.levelDottoratoen
degree.disciplineFacoltà di medicina e chirurgiaen
degree.grantorUniversità degli studi di Roma Tor Vergataen
date.dateofdefenseA.A. 2007/2008en
Appears in Collections:Tesi di dottorato in medicina

Files in This Item:

File Description SizeFormat
tesi.ghiglieri.pdfThesis473KbAdobe PDFView/Open
figure.ghiglieri.pdfFigures2191KbAdobe PDFView/Open

Show simple item record

All items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved.