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Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/2108/723

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contributor.advisorPalamara, Anna Teresa-
contributor.authorSgarbanti, Rossella-
date.accessioned2008-12-17T10:16:27Z-
date.available2008-12-17T10:16:27Z-
date.issued2008-12-17T10:16:27Z-
identifier.urihttp://hdl.handle.net/2108/723-
description20. cicloen
description.abstractL’emoagglutinina (HA), glicoproteina del virus influenzale presente sotto forma di omotrimero nell’envelope virale, è la principale responsabile dell’adesione e dell’entrata del virus nella cellula ospite. Il folding dell’HA avviene nel reticolo endoplasmatico (RE) dove la formazione dei legami disulfidici è favorita da condizioni ossidanti. La proteina così foldata passa nel Golgi dove subisce ulteriori processi di glicosilazione. Una variazione dello stato redox intracellulare in senso pro-ossidante è stata riscontrata in varie infezioni virali, tra cui quella provocata dal virus influenzale. Il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato che la somministrazione di gluttaione ridotto (GSH) corregge lo stress ossidativo ed inibisce la replicazione di virus a RNA e DNA sia in vitro che in vivo. Più recentemente è stata descritta l’attività antivirale del GSH-C4, derivato butanoile del GSH con aumentate proprietà idrofobiche, contro il virus Sendai e Herpes Simplex-1. Obiettivo dello studio è stato quello di valutare l’efficacia del GSH-C4 sulla replicazione del virus influenzale A/PR8/H1N1 studiando in particolare il suo effetto nel processo di maturazione dell’HA. I risultati ottenuti hanno dimostrato che il GSH-C4 ha inibito la replicazione virale di diversi ceppi di virus influenzale (ceppo umano A/PR8 H1N1, ceppo umano A/NWS H1N1 e ceppo aviario A/Parrot/ULSTER/73 H7N1) in maniera dose-dipendente. In particolare, il titolo virale, nelle cellule trattate con GSH-C4 10 mM, era ridotta del 90% rispetto al controllo, senza alcun effetto tossico sulle cellule non infettate. L’analisi in western blot delle proteine virali ha dimostrato che nelle cellule trattate con GSH-C4 l’inibizione del titolo virale era associata ad una diminuzione del peso molecolare dell’emoagglutinina rispetto alle cellule di controllo. Tale effetto non era dovuto ad un effetto diretto sulla glicosilazione o sul trasporto dell’HA come dimostrato da esperimenti effettuati con inibitori degli enzimi coinvolti nella glicosilazione e inibitori del trasporto. Western blot effettuati in condizioni non riducenti, in presenza o in assenza di NEM, hanno dimostrato che in cellule NCI infettate e trattate con GSH-C4 l’espressione dell’HA in forma trimerica era diminuita rispetto alle cellule di controllo e la proteina era prevalentemente in una forma monomerica ridotta. Inoltre, PDI, un’ossidoreduttasi responsabile della formazione del legame disulfidico nel RE, era mantenuta in forma ridotta. Il trattamento degli estratti cellulari con Endo H ha evidenziato che in presenza di GSH-C4 l’HA era prevalentemente nel RE. Allo stesso tempo l’osservazione mediante immunofluorescenza ha evidenziato che la localizzazione della HA sulla membrana cellulare, fenomeno normalmente osservato 8 ore dopo l’infezione nelle cellule di controllo, è fortemente diminuita nelle cellule trattate con GSH-C4. I risultati ottenuti suggeriscono che la minima diminuzione di peso molecolare dell’HA indotta dal GSH-C4 si riflette in un accumulo della proteina immatura e fornisce l’evidenza che il GSH-C4 inibisce la replicazione del virus influenzale interferendo con il processo di maturazione dell’HA.en
description.abstractHemagglutinin (HA) is a homotrimeric integral membrane glycoprotein of influenza virus that is responsible for the binding of viral particles to sialic acid-containing receptor on cell surface. Folding of HA starts in the endoplasmic reticulum (ER), where the oxidizing conditions and the presence of lectins and oxidoreductases supports N-linked glycosylation and disulfide bond formation. Then, the folded HA moves through the Golgi apparatus to the cell membrane. We previously reported that glutathione (GSH) inhibited replication of several viruses by restoring intracellular reducing conditions altered by infection. The present study was aimed at determining whether: i) the GSH derivative GSH-C4 inhibits influenza virus replication; ii) this effect is mediated by an alteration in HA maturation. In MDCK cells, influenza virus replication was dose-dipendently inhibited by 1-15 mM GSH-C4. At 10 mM, GSH-C4 reduced by 90-95% the replication of different strains of influenza virus (human A/PR8/H1N1, human A/NWS/H1N1 and avian A/Parrot/ULSTER/73/H7N1), without producing toxic effects on uninfected cells. Western blot of viral proteins extracted from GSH-C4-treated human pulmonary NCI-H292 cells demonstrated that this inhibition was associated with a slight decrease in the apparent molecular weight of HA. By comparing the effects of GSH-C4 with that of HA glycosylation- and transport- inhibitors, we demonstrated that this event was not due to a direct alteration of HA glycosylation and transport. Western blot performed in non reducing conditions, with or without NEM, showed that GSH-C4 caused a reduction of HA dimeric and trimeric forms along with an increase of its reduced form. Consistently, PDI, an oxidoreductase responsible for disulfide bond formation in the ER, was predominantly found in the reduced form, that physiologically prevents its function. Moreover, HA extracted from GSH-C4 treated cells was sensitive to Endo H digestion thus confirming that the protein is kept in the ER. Finally, HA immunolabelling showed that GSH-C4 markedly reduced insertion of the protein in the cell membrane. Altogether, these results suggest that the slight decrease in the HA molecular weight induced by GSH-C4 reflects an accumulation of the immature HA and provide the evidence that GSH-C4 inhibits influenza virus replication by interfering with the maturation process of HA.en
format.extent7034215 bytes-
format.mimetypeapplication/pdf-
language.isoenen
subjectvirus influenzaleen
subjectinfluenza virusen
subjectemoagglutininaen
subjectstato redoxen
subjectglutationeen
subjecthemagglutininen
subjectredox stateen
subjectglutathioneen
subject.classificationMED/07 Microbiologia e microbiologia clinicaen
titleRedox regulation of the influenza hemagglutinin maturation process: a new cell mediated strategy for antinfluenza therapyen
typeDoctoral thesisen
degree.nameDottorato in microbiologia medica ed immunologiaen
degree.levelDottoratoen
degree.disciplineFacoltà di medicina e chirurgiaen
degree.grantorUniversità degli studi di Roma Tor Vergataen
date.dateofdefenseA.A. 2007/2008en
Appears in Collections:Tesi di dottorato in medicina

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